تخلیص و جداسازی آنزیم ترانس کیتولاز از گلبول قرمز خون انسان وشناسایی سایت های اتصالی یون کلسیم در جایگاه فعال آنزی

چکیده : آنزیم ترانس کیتولاز اریتروسیت انسانی 1(و 1، 2و) ec 2 با استفاده از خصوصیات چون رسوب پروتئین ها بانمک سولفات آمونیوم کروماتوگرافی و دیالیز معمولی با درجه خلوص بالائی 14 u/mg استخراج گشت . از الکتروفورزژل پلی آکریلامید sds برای بررسی ساب یونیت های این آنزیم استفاده شد برطبق تجربیات الکتروفورز مشخص شد که این آنزیم از دو فرم دیمرکه خود متشکل از چهار مونومراست به وزن مولکولی 57 -60000 و80 - 84000 تشکیل شده است در مرحله خالص سازی در مرحله اول از سولفات آمونیوم استفاده شد و این باعث شد که ازهمان ابتدا آنزیم 11 بار خالص گردد بدین ترتیب که با اندازه گیری فعالی آنزیم در مرحله رسوب در مقایسه با مرحله همولیزیت افزایش فعالیتی معادل 10 برابر مقدار اولیه نشان داده شد این مسئله گام مهمی در خالص سازی سریع آنزیم محسوب می شود . در مرحله نهایی خالص سازی یعنی مرحله استفاده از رزین سفادکس bae برای کروماتوگرافی میزان تخلیص به2233 مرتبه افزایش یافت . باانجام کارهای سینتیکی روی این آنزیم، سه سایت فعال هیستیدینی در آن تشخیص داده شد بدین ترتیب که وقتی درph های مختلف درصد تغییرات جذب نوری آنزیم ترانس کیتولاز اریتروسیت انسانی در حضور و عدم حضور کلسیم بدست آمد و رسم شد نقاط مینیمم بدست آمده در ph های 6/36 -6/25 و 6/88 وجود ساختمانی ایمیدازولی (هیستدینی) در سایت فعال آنزیم را نشان داد زیرا این نقاط در واقع pka گروههای فعال آنزیم در اتصال به یون فلزی می باشد که معادل با pka گروه ایمیدازولیوم در هیستیدین است . این امر درد و آزمایش دیگر یعنی اندازه گیری تغییرات فعالیت بخصوص آنزیم و سرعت اتصال یون کلسیم به آنزیم در ph های مختلف تائید شد. و نیز مشخص شد که در ph=6/88 فعالیت مخصوص و سرعت اتصال یون کلسیم به آنزیم افزایش قاب ملاحظه ای داشته است یعنی این سایت در فعالیت کاتالیتیکی آنزیم و اتصال آن به یون کلسیم فعالتر است .